Fundamentación teórica

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

La contaminación microbiológica del agua puede tener dos aportes:

-          Autóctono, correspondiente a la flora cuyo hábitat es acuático (Pseudomonas, Bacillus, Proteus, cianobacterias, etc)

-          Exógeno, correspondiente al aporte de alguna descarga sobre el agua, como la contaminación cloacal (enterobacterias, enterococos) o del suelo en constante relación con la fuente (Bacillus)

Un análisis microbiológico del agua exige, según el Código Alimentario Argentino, realizar las siguientes determinaciones:

1)   Recuento de bacterias aerobias totales

Se realiza un recuento en superficie sobre medio APC (agar para conteo), el cual no debe exceder las 500 UFC/ml. Debido a que se siembran 0,1 ml de agua por placa, en cada una no deben crecer más de 50 colonias o UFC (Unidades Formadoras de Colonias).

Este dato es importante para saber qué calidad tiene el agua de consumo proveniente de un reservorio, sin embargo no nos informa acerca de si la contaminación es de origen autóctono o exógeno. Por eso es necesario realizar el resto de los análisis y en el caso que sólo este parámetro se encuentre fuera del rango, se deberá exigir la higienización del reservorio y con posterioridad realizar un nuevo recuento.

Protocolo

Día 1

Materiales:

• Placas de Petri con Agar para conteo (APC): 3 por muestra
• Rastrillos
• Placas de vidrio con alcohol
• Mecheros
• Tips estériles azules y amarillos
• Estufa a 37ºC
• Espadol

• Algodón
• Marcador indeleble
• Cinta de papel
• Guardapolvo
• Agua estéril
• Micropipetas P200 y/o P1000 o pipetas estériles (con perita o propipeta)

Desarrollo:

-          Se siembran tres placas por muestra. Agitar bien las muestras y sembrar 0,1ml de cada una, rastrillar y dejar a 37ºC por 48hs. Incluir un control negativo con agua estéril.

-          Si se sospecha que la muestra puede tener alta cantidad de bacterias aerobias (muestra muy turbia), diluirla (por ej. 1:10 y 1:50) y sembrar 0,1ml de las diluciones.

Día 2

Materiales:

• Guantes
• Guardapolvo

Desarrollo:

-          Mirar las placas y fijarse si crecieron hongos, que pueden colonizar toda la placa y dificultar el recuento de colonias. Si es así, tratar de contar las Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) ese mismo día (las colonias son chiquitas, pero pueden detectarse por diferente refringencia a contraluz).

-          Guardarlas en heladera para su posterior análisis.

Día 3

Materiales:

• Bolsa roja para descarte de patogénicos
• Guantes
• Guardapolvos

Desarrollo:

-          Recuento de colonias. Si se sembraron 0,1ml, se debe multiplicar el valor por 10, para informar aerobias totales por ml. La muestra se considera contaminada si supera las 500 UFCs/ml en promedio de las placas (para poder promediar las placas, los valores deberían ser similares). Esto representa 50 colonias por placa. Si hay más de 200 colonias, es aconsejable contar UFCs en una placa donde se haya sembrado una muestra más diluida.

2)    Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 100 ml de muestra

El género Pseudomonas se caracterizan por ser bacilos gram negativos, móviles, aerobias estrictas y de metabolismo oxidativo. Algunas especies sintetizan pigmentos, tal como P. aeruginosa, una bacteria autóctona del agua, capaz de producir afecciones en humanos (por ejemplo respiratorias, dermatológicas, etc.) y la única del género que puede crecer a 43ºC. Para detectarla, empleamos un kit, que concentra una muestra de 100ml mediante su filtrado (asistido por una bomba). Como medio de cultivo se utiliza agar cetrimida que contiene altas concentraciones de una sal de amonio cuaternaria (N-cetil-N,N,N-trimetilamonio o cetrimida), lo cual inhibe el crecimiento de otras bacterias de metabolismo oxidativo. Esto lo hace un medio selectivo para el género Pseudomonas. Es además un medio diferencial, debido a que su alta concentración de sales permite ver colonias de P. aeruginosa al provocar la precipitación de un pigmento (piocinanina, detectado con luz UV) producido por esta especie, que da a la colonia un color verdoso. Para verificar que se trata de P. aeruginosa (y diferenciarla de P. fluorescens), las colonias que fluorescen al UV, se repican en agar cetrimida, se incuban a 43ºC y luego se extrae con cloroformo el pigmento de las placas con crecimiento.  

Protocolo

La determinación se realiza a través de una etapa de filtración (para concentrar las muestras) y una de crecimiento en medio selectivo (Agar Cetrimida).

Día 1

Materiales:

• Monitores para la Filtración
• Medio de cultivo Cetrimida
• Bomba de vacío y Kitasato
• Estufa a 37ºC
• Flujo Laminar
• Guantes y guardapolvo

Desarrollo:

-          Armar el frasco del kit (“monitor”) en el dispositivo de filtración.

-          Agitar bien la muestra y volcar 100 ml de la misma en el monitor.

-          Filtrar.

-          Desensamblar la base del monitor y colocarle la tapa. La parte del medio se descarta.

-          Inyectar por abajo el medio de cultivo (Agar Cetrimida). Dar tiempo a que el filtro se embeba bien antes de retirar el dispositivo.

-          Tapar el orificio.

-          Incubar la placa 48hs a 37°C

Día 2 (48hs después)

Materiales:

• Lámpara UV
• Guardapolvo
• Anteojos protectores de luz UV

Desarrollo:

-          Iluminar el filtro con luz UV a 265 nm (¡protegerse los ojos!).

-          Realizar el recuento de colonias fluorescentes

-          Marcarlas para su posterior repique

Día 3

Materiales:

• Placas de agar cetrimida (3 o 4 por muestra positiva)
• Bolsa roja para descarte de patogénicos

• Guardapolvo
• Guantes
• Estufa a 43°C

Desarrollo:

-          Repicar las colonias positivas (3 o 4 por muestra) a placas de Agar Cetrimida e incubarlas a 43° por 24-48hs.

Día 4 (48hs después)

Materiales:

• Guantes
• Guardapolvo

Desarrollo:

-          Pasar las muestras de la estufa a la heladera para su posterior análisis.

Día 5

Materiales:

• Tubos de ensayo limpios
• Cloroformo
• Bolsa roja para descarte de patogénicos

• Guantes
• Guardapolvo
• Lámpara UV
• Anteojos protectores de luz UV

Desarrollo:

De las placas que finalmente crecieron:

-          Extracción del pigmento piocianina: Colocar 1-2 ml de cloroformo por placa positiva, mezclar con cuidado y traspasar la fase líquida a un tubo limpio.

-          Observar un color azulado en el líquido obtenido (se puede ver también con luz UV).

-          Descartar las placas en bolsa roja.

3)    Detección de contaminación cloacal

La importancia de determinar contaminación cloacal radica en que su presencia puede ser indicativa de agentes patogénicos que causan enfermedades humanas (cólera, hepatitis, giarditis, poliomielitis, etc.). Dado que estos patógenos pueden encontrarse en baja abundancia y ser difícil su detección, se utilizan distintos indicadores de contaminación cloacal; en nuestro caso, bacterias de origen entérico del grupo Enterobacterias que tienen una supervivencia en agua mayor que los agentes patógenos y son, por consiguiente, más fácilmente detectables.

Al encontrarse diluidas en las muestras de agua, se deben aplicar para su determinación métodos estadísticos como el del “Número Más Probable” (NMP), que utiliza grandes volúmenes de muestra. En nuestro caso usaremos el método Wilson, para calcular el número de bacterias coliformes cada 100 ml de muestra. Se define bacteria coliforme como aquella enterobacteria capaz de fermentar lactosa, liberando ácido y gas (las no coliformes también fermentan y producen ácido pero no gas). El medio de cultivo utilizado (caldo Brila Fluorocult) posee lactosa (fuente de carbono fermentable), bilis de buey (que es selectiva para enterobacterias), triptofano y 4-metilumbeliferil-b-D-glucurónido o MUG (metabolitos que pueden ayudar a la detección de Escherichia coli, bacteria coliforme de origen fecal). Aquellos tubos con crecimiento y gas se cultivan en caldo citrato de Koser, que permite detectar por crecimiento selectivo a bacterias coliformes no fecales, por poseer citrato como única fuente de carbono el cual no puede ser utilizado por coliformes de origen fecal.

Protocolo

Día 1

Materiales:

• Tubos de ensayo grandes con 10ml de caldo Brila Fluorocult 2X y campana de Durham: al menos 3 por muestra (preferentemente más para diluciones y control negativo).
• Tubos de ensayo chicos con 5ml de caldo Brila Fluorocult 1X y campana de Durham: al menos 6 por muestra (preferentemente más para diluciones y control negativo).

• Pipetas estériles de 10ml
• Peritas o propipetas
• Micropipetas P1000 y P200
• Tips estériles azules y amarillos
• Estufa a 37ºC
• Espadol y algodón
• Marcador indeleble
• Cinta de papel

• Guardapolvo
• Bolsa roja para descarte de patogénicos
• Agua estéril

Desarrollo:

-          Agitar enérgicamente la muestra.

-          Si la muestra es demasiado turbia, es aconsejable diluirla (por ej. 1:10 y 1:50) y sembrarlas junto a la muestra sin diluir.

-          Sembrar por cada muestra:

o   3 tubos de 10ml de caldo Brila 2X con 10ml de muestra.

o   3 tubos de 5ml de caldo Brila 1X con 1ml de muestra.

o   3 tubos de 5ml de caldo Brila 1X con 0,1ml de muestra.

Agitar la muestra entre siembra y siembra para evitar que se depositen las bacterias. Incluir un juego de tubos sembrados con agua estéril, como control negativo.

-          Incubar 48hs a 37ºC sin agitación.

Día 2 (48hs después)

Materiales:

• Espadol y algodón
• Marcador indeleble
• Cinta de papel
• Guardapolvo

Desarrollo:

-          Observar los tubos y anotar el número de positivos para coliformes por muestra (crecimiento y gas en al menos 1/3 de la campana). Los no coliformes muestran crecimiento pero no gas.

-          Para que el ensayo sea válido, la mayoría de los tubos de menor concentración deben ser negativos para gas y positivos para crecimiento. Descartar las diluciones que no cumplan esta condición.

-          Determinar con la tabla el número más  probable (X) de coliformes totales cada 100ml de muestra.

-          Guardar los tubos de Brila positivos para su análisis posterior

Día 3

Materiales:

• Tubos de caldo citrato de Koser: 1 por tubo de caldo Brila sembrado (grande o chico)
• Ansas rectas
• Estufa a 37ºC

• Espadol y algodón
• Marcador indeleble
• Cinta de papel
• Guardapolvo
• Guantes

Desarrollo:

-          De los cultivos positivos para crecimiento y gas, se siembra una ansada en caldo citrato de Koser. Usar ansa recta para llevar la menor cantidad posible de medio Brila al caldo citrato (que sólo debe tener citrato como fuente de carbono). Incluir un control negativo con un caldo Brila que no muestre crecimiento (o agua estéril).

-          Incubar a 37ºC durante 48hs.

-          Guardar los tubos de Brila positivos para su análisis posterior

Día 4 (48hs después)

Materiales:

• Guantes
• Guardapolvo
• Bolsa roja para descarte de patogénicos

Desarrollo:

-          Agitar y observar los tubos de caldo citrato de Koser. Se consideran coliformes no fecales (pueden crecer con citrato como única fuente de carbono) si hay turbidez.

-          Obtener el número más probable (NMP) de coliformes no fecales (b).

Día 5

Materiales:

• Reactivo de Kovacs
• Lámpara UV
• Micropipetas P1000
• Tips estériles azules
• Espadol
• Algodón
• Marcador indeleble
• Cinta de papel
• Guardapolvo
• Guantes
• Bolsa roja para descarte de patogénicos

Desarrollo:

-          Mirar los tubos positivos de Brila con luz UV. Si se observa fluorescencia azul (producida por un producto de clivaje del MUG) se consideran positivos para coliformes fecales y Escherichia coli.

-          Para corroborar que sea E. coli, se realiza la prueba del indol (que detecta productos metabólicos del triptofano), agregando 0,1ml de reactivo de Kovacs. Si se observa viraje al rojo en la superficie, es positivo. NO AGITAR.

Se puede ir agregando reactivo si con 0,1 ml no se alcanza a ver el color del mismo.

-          Obtener el número más probable (NMP) de coliformes fecales (a).

-          Corregir los datos según la siguiente fórmula:

o   #Coliformes fecales/100ml = X * a / (a+b)

o   #Coliformes no fecales/100ml = X * b / (a+b)