Análisis Microbiológicos

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS - DÍA A DÍA

DÍA 1
Materiales
Aerobios totales		Pseudomonas
Placas de Petri con Agar para conteo (APC): 3 por muestra		Monitores para la Filtración
		Medio de cultivo Cetrimida
Rastrillos		Bomba de vacío y Kitasato
Placas de vidrio con alcohol		Flujo Laminar
Mecheros		Guantes
Contaminación cloacal
Tubos de ensayo grandes con 10ml de caldo Brila Fluorocult 2X y campana de Durham: al menos 3 por muestra (Preferentemente más para diluciones y control negativo).
Tubos de ensayo chicos con 5ml de caldo Brila Fluorocult 1X y campana de Durham: al menos 6 por muestra (Preferentemente más para diluciones y control negativo).
General
Tips estériles azules y amarillos		Estufa a 37ºC
Micropipetas P200 y/o P1000		Espadol
Pipetas estériles de 10ml (con perita o propipetas)		Algodón
		Guardapolvo
Agua estéril		Bolsa roja para descarte de patogénicos
Marcador indeleble		Cinta de papel

Desarrollo

Aerobios totales

1.    Se siembran dos placas por muestra. Agitar bien las muestras y sembrar 0,1ml de cada una, rastrillar y dejar a 37ºC por 48hs. 2.    Incluir un control negativo con agua estéril. Si se sospecha que la muestra puede tener alta cantidad de bacterias aerobias (muestra muy turbia), diluirla (por ej. 1:2 y 1:5) y sembrar 0,1ml de las diluciones.

Pseudomonas

1.    Armar el frasco del kit (“monitor”) en el dispositivo de filtración. 2.    Agitar bien la muestra y volcar 100 ml de la misma en el monitor. 3.    Filtrar. 4.    Desensamblar la base del monitor y colocarle la tapa. La parte del medio se descarta. 5.    Inyectar por abajo el medio de cultivo (Agar Cetrimida). Dar tiempo a que el filtro se embeba bien antes de retirar el dispositivo. 6.    Tapar el orificio. 7.    Incubar la placa 48hs a 37°C

Contaminación cloacal

1.    Agitar enérgicamente la muestra. Si la muestra es demasiado turbia, es aconsejable diluirla (por ej. 1:2 y 1:5) y sembrarlas junto a la muestra sin diluir. 2.    Sembrar por cada muestra: 3 tubos de 10ml de caldo Brila 2X con 10ml de muestra. 3 tubos de 5ml de caldo Brila 1X con 1ml de muestra. 3 tubos de 5ml de caldo Brila 1X con 0,1ml de muestra. Agitar la muestra entre siembra y siembra para evitar que se depositen las bacterias. 3.    Incluir un juego de tubos sembrados con agua estéril, como control negativo. 4.    Incubar 48hs a 37ºC sin agitación.

DÍA 2
Materiales
Pseudomonas	General
Lámpara UV	Bolsa roja para descarte de patogénicos
Anteojos protectores para luz UV	Guantes y guardapolvo

Desarrollo

Aerobios totales

Mirar las placas y fijarse si crecieron hongos, que pueden colonizar toda la placa y dificultar el recuento de colonias. Si es así, tratar de contar las Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) ese mismo día (las colonias son chiquitas, pero pueden detectarse por diferente refringencia a contraluz). Guardar las placas en heladera

Pseudomonas

Iluminar el filtro con luz UV a 265 nm (¡protegerse los ojos!). Realizar el recuento de colonias fluorescentes. Guardar las placas en heladera

Contaminación cloacal

Observar los tubos y anotar el número de positivos para coliformes por muestra (crecimiento y gas en al menos 1/3 de la campana). Los no coliformes muestran crecimiento pero no gas. Para que el ensayo sea válido, la mayoría de los tubos de menor concentración deben ser negativos para gas y positivos para crecimiento. Descartar las diluciones que no cumplan esta condición. Determinar con la tabla el número más  probable (X) de coliformes totales cada 100ml de muestra. Descartar los tubos negativos y guardar los positivos en heladera.

DÍA 3
Materiales
Pseudomonas		General
Placas con agar cetrimida: 3 o 4 por cada placa positiva		Bolsa roja para descarte de patogénicos
		Guantes
Estufa a 43ºC		Guardapolvo
Contaminación cloacal
Tubos de caldo citrato de Koser: 1 por tubo de Brila sembrado		Espadol y algodón
		Estufa a 37ºC
Ansas rectas		Marcador indeleble y cinta de papel

Desarrollo

Aerobios totales

Recuento de colonias. Si se sembraron 0,1ml, se debe multiplicar el valor por 10, para informar aerobias totales por ml. La muestra se considera contaminada si supera las 500 UFCs/ml en promedio de las placas (para poder promediar las placas, los valores deberían ser similares). Esto representa 50 colonias por placa. Si hay más de 200 colonias, es aconsejable contar UFCs en una placa donde se haya sembrado una muestra más diluida. Descartar las placas en bolsa roja.

Pseudomonas

Repicar las colonias positivas (3 o 4 por muestra) a placas de agar cetrimide Incubar a 43ºC durante 24-48hs

Contaminación cloacal

De los cultivos positivos para crecimiento y gas, se siembra una ansada en caldo citrato de Koser. Usar ansa recta para llevar la menor cantidad posible de medio Brila al caldo citrato (que sólo debe tener citrato como fuente de carbono). Incluir un control negativo con un caldo Brila que no muestre crecimiento (o agua estéril). Incubar a 37ºC durante 48hs. Devolver los tubos con caldo Brila a la heladera

DÍA 4

Materiales

General

Bolsa roja para descarte de patogénicos

Guardapolvo

Guantes

Desarrollo

Pseudomonas

Pasar las muestras de la estufa a la heladera

Contaminación cloacal

Agitar y observar los tubos de caldo citrato de Koser. Se consideran coliformes no fecales (pueden crecer con citrato como única fuente de carbono) si hay turbidez. Obtener el número más probable (NMP) de coliformes no fecales (b). Descarte de los tubos de citrato de Koser.

DÍA 5
Materiales
Pseudomonas	Contaminación cloacal
Cloroformo y tubos	Reactivo de Kovacs
General
Bolsa roja para descarte de patogénicos	Guantes
Lámpara UV	Guardapolvo
Anteojos protectores para luz UV	Lavandina

Desarrollo

Pseudomonas

Realizar la extracción del pigmento piocianina por extracción con cloroformo: Colocar 1-2 ml de cloroformo en cada placa positiva Traspasar a un tubo limpio (se debería observar a simple vista un color azulado) Observar fluorescencia con la utilización de una lámpara UV portátil. Descartar las placas en bolsa roja.

Contaminación cloacal

Mirar los tubos positivos con luz UV. Si se observa fluorescencia azul (producida por un producto de clivaje del MUG) se consideran positivos para coliformes fecales y Escherichia coli. Para corroborar que sea E. coli, se realiza la prueba del indol (que detecta productos metabólicos del triptofano), agregando 0,1ml de reactivo de Kovacs. Si se observa viraje al rojo en la superficie, es positivo. NO AGITAR. Se puede ir agregando reactivo si con 0,1 ml no se alcanza a ver el color del mismo. Obtener el número más probable (NMP) de coliformes fecales (a). Corregir los datos según la siguiente fórmula:                                     # Coliformes fecales/100ml = X * a / (a+b) # Coliformes no fecales/100ml = X * b / (a+b) Descartar en bolsa roja y dejar los tubos con lavandina 10%.